组织表达序列变异以及与种子含油量和纤维质量的关联

棉花不仅是世界上最重要的纤维作物,也是不可替代的油料作物。 棉纤维占棉花作物农场交货值的 85%,其余为棉籽、籽粕和籽油。

 

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棉籽油是一种补充产品,可用于食品或作为生物柴油生产的原料。 与菜籽油、大豆油相比具有质量和价格优势。 棉籽油约占种子重量的16%,是从棉籽中提取的。 作为最有价值的产品,全球市场对棉籽油的需求正在稳步增长。

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目前,通过基因改造提高棉籽油产量的策略主要有两种,即通过传统育种提高棉籽油的比例,以及通过基因改造提高棉籽油的品质和含量。 然而,目前尚不清楚是否可以通过操纵与植物油生物合成相关的基因来实现。 增加棉籽油产量。

植物油主要由三酰甘油组成,是主要的储存脂质。 植物中TAG生物合成有两种途径。 第一条途径是通过Kennedy途径从头生物合成3-磷酸甘油和酰基辅酶A,该途径涉及三种酰基转移酶,即3-磷酸甘油O-酰基转移酶、溶血磷脂酸酰基转移酶和二酰基甘油酰基转移酶。

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在哺乳动物中,LPAAT 被鉴定为 1-酰基-甘油-3-磷酸 O-酰基转移酶家族的一部分,其中 LPAAT1 至 5 对应于 AGPAT1 至 5,LPAATƞ 对应于 AGPAT7。

DGAT属于膜结合O-酰基转移酶家族,该家族包括植物中的四个亚家族,即MBOAT1、DGAT1、溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶或溶血磷脂酰酰基转移酶以及酿酒酵母甘油摄取蛋白的同源物。

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磷脂酸(PA)是TAG生物合成的关键中间体。 在一些组织和生物体中,由 GPAT 催化的第一个酰化步骤可以部分被磷酸二羟丙酮酰基转移酶绕过。

因此,LPAAT 对于 PA 生物合成至关重要,可以催化酰基掺入甘油主链的 sn-2 位。 在高等植物中,LPAAT催化的两条途径控制溶血磷脂酸进入不同组织中不同PA的代谢流。 PA 可以去磷酸化形成 TAG,也可以用于合成磷脂(生物膜的重要组成部分)。

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因此,LPAAT 对于发育种子中膜磷脂和储存脂质的生物合成至关重要。 事实上,在高等植物中,LPAAT通过降低饱和脂肪酸的比例,在改善种子的脂肪酸组成方面发挥着重要作用。

LPAAT 被认为是具有最严格底物特异性的酰基转移酶之一。 对不同植物物种中LPAAT的酰基特异性的研究表明,它们对16-18碳单不饱和脂肪酸的亲和力比对SFA的亲和力更强。 。

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不同植物物种中至少有两类LPAAT基因。 根据 Frentzen 的定义,A 类微粒体 LPAAT 特征在整个植物中普遍表达,并且它们的酶对 18:1-CoA 显示出特异性。

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这些是生物合成膜甘油脂的酶的典型特征。 B 类 LPAAT 首次从椰子中克隆并表征。 在这个亚家族中,LPAAT 基因通常在种子中表达。 它们编码的酶对不常见的酰基(例如芥酸和月桂酸)具有很强的底物特异性。 与上述物种的种子微粒体活性和油脂成分一致。

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然而,最近的研究表明,B 类 LPAAT 的特征在其他物种中可能有所不同,例如来自蓖麻油的 B 类 LPAAT 显示出对 18:1-OH 的特异性。

此外,LPAAT的过度表达增加了种子油含量,从而增强了LPAAT基因作为有价值的生物技术工具的效用,因此已经从煮茄子、拟南芥、油菜籽、椰子、玉米、水芹、爪哇橄榄和蓖麻子中克隆了LPAAT同源物。

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在拟南芥和甘蓝型油菜中,由SLCl-1突变酵母染色的LPAAT基因的过表达增加了长链脂肪酸掺入TAG的sn-2位置,导致种子油含量增加8-48%。 然而,迄今为止,尚未使用来自棉花的LPAAT基因进行此类转基因工作。

迄今为止,人们对 LPAAT 基因的自然变异及其与包括棉花在内的高等植物种子油生产的关系知之甚少,并且编码这些酶的基因尚未在棉花中得到表征。

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因此,它们在增加棉籽油含量方面的作用尚不清楚,并且由于脂肪酸对于膜生物合成至关重要,因此发现饱和超长链脂肪酸可以促进棉纤维细胞伸长。

然而,LPAAT基因的自然遗传变异与纤维发育之间的关系目前尚不清楚。 具有相同遗传背景但含油量、纤维起始或伸长不同的近等基因系或回交自交系可用于纤维发育的研究。 与发育和种子含油量相关的 LPAAT 基因提供了重要的遗传库。

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LPAAT家族的基因组结构主要仅在拟南芥和蓖麻中进行了研究,而没有在包括棉花在内的其他物种中进行研究,而棉花的生产力和适应性更强,生产了世界上约95%的棉花纤维和种子。

另一种栽培的四倍体,占世界棉花产量的其余部分,与陆地棉相比,产生更长、更强、更细的纤维,棉籽油含量更高,蛋白质含量更低,因此两个物种之间的种间杂交产生的 BIL 为棉花生产提供了重要的遗传库。解决与棉籽油含量和纤维质量相关的 LPAAT 问题。

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最近对两个栽培四倍体棉花品种的基因组进行了测序。 在这项研究中,我们对两个异源四倍体物种及其可能的祖先二倍体物种棉(Gossypium gossypii)和雷蒙德·尼(Raymond Ni)的基因组进行了测序。 鉴定出 40 个 LPAAT 基因,后者的基因组较早进行了测序。

在对 LPAAT 基因家族的系统发育、基因组组织和基因结构进行计算机分析后,我们通过分析两个 RNA-seq 数据集中的信息,然后进行定量实时 RT,对 LPAAT 的转录谱进行了详细分析-PCR分析。 识别基因家族。

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进一步评估每个基因内的序列变异,以开发多态性标记以及与棉籽油含量和纤维品质性状的关联分析。 转基因酵母研究中使用了具有序列变异的 LPAAT 基因来确认其对 TAG 的反应。 影响。

该研究代表了植物中最全面的基因组方法之一,将计算机生物信息学分析与 RNA 水平的转录组学、DNA 水平的 SNP 识别和分型及其与种子油和纤维质量的关联相结合。

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LPAAT 活性在质膜和线粒体中检测到。 总结了棉花中假定的 LPAAT 蛋白的预测亚细胞定位,以及预测为特定的每个 LPAAT 亚家族的预测长度、分子量 (MW) 和等电点 (pI)。 亚细胞位置。

在该亚家族中,72.7%的LPAAT蛋白预计位于内质网中; LPAAT4/5、B 类 LPAAT 和 LPAAT1 预计分别位于质膜、线粒体内膜和质膜。

四倍体陆地棉两个RNA-seq数据库中GhLPAAT基因转录水平分析

为了揭示已识别的 LPAAT 基因的一般基因表达模式,我们分析了两个 RNA-seq 数据集中 LPAAT 基因的转录谱:一个包含两个 UplandBIL(即 NMGA-062 和 NMGA-105)的转录组信息。

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另一种含有UplandXuzhou142及其无纤维和无绒突变体转录组信息的突变体是Xuzhou142fl,它们的纤维长度不同,但种子油含量相似,它的纤维引发和棉籽油含量不同。

所有 13 个假定的 LPAAT 基因的转录本丰度均在纤维起始和伸长阶段测定。 在已测序的陆地棉基因组中的 13 个基因中,有两个基因不表达,另外 11 个基因在纤维发育的两个阶段都表达。 在两个 RNA-seq 数据集中代表的所有阶段和所有组织中都被转录。

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根据两个BIL的RNA-seq数据,两个基因型中A类LPAAT基因的转录水平均高于其他三个亚家族。 三个不同阶段在维持高表达水平方面是相似的。 在 0 个 DPA 纤维胚珠中表达水平较低,在两种基因型的 10 个 DPA 胚珠中观察到最高水平。

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纤维长度不同但种子含油量相似的两种BIL基因型的表达水平无显着差异。

八个 GhLPAAT 基因转录谱的实时定量 RT-PCR 分析

由于同一亚科内的基因具有较高的同源性,我们在陆地棉中表达的11个LPAAT基因中选择了8个与其祖先二倍体种G.raimondii具有同源性,并设计了基因特异性引物以进一步评估转录水平。

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这八个基因包括两个A类基因、两个LPAAT4/5基因、三个质体LPAAT基因和一个B类基因。 利用qRT-PCR分析,我们进一步分析了徐州142和徐州142fl的根、茎和茎。 叶子、花瓣、胚珠和纤维中的基因转录水平。

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我们分析了不同发育阶段的胚珠,即-3、-1、0、1、3和5 DPA,以及10、15、20和25 DPA,因为棉籽油在15-20 DPA后在胚珠中迅速积累,并且结果显示,8 每个LPAAT 基因在整个植株的所有测试器官和组织中都有表达。

然而,7个LPAAT基因在10个DPA纤维中表现出最高的转录水平,并且At-Gh6LPAAT1、At-Gh1LPAAT2、At-Gh1LPAAT3、At-Gh13LPAAT5和Dt-Gh1LPAATB在徐州142fl的胚珠发育后期优先表达,尤其是在 20DPA 时。

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两个A类基因的转录谱相似; 然而,在LPAAT4/5亚家族中,Dt-Gh6和LPAAT4的转录模式表现出相反的趋势,其中Dt-Gh6位于-3至5个DPA胚珠和10个DPA纤维。 Gh6LPAAT4 显示出非常低的转录水平,而 At-Gh13LPAAT5 则高度表达。

此外,Dt-Gh6LPAAT4 显示出非常高的转录水平,但 At-Gh13LPAAT5 在 15-25 DPA 纤维中表达水平较低,并且在 B 类亚家族中,Dt-Gh1LPAATB 没有显示出预期的种子特异性表达模式,因为它是也表达于所有其他器官。

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棉花LPAAT基因家族

这项研究的结果揭示了四个基因组测序多基因家族中 40 个 LPAAT 基因的详细信息:二倍体 G.raimondii 和 G.arboreum,及其后代,四倍体 G.hirsutum 和 G.barbadense。

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翻译的蛋白质序列被分为四组(亚科),与之前的其他报道一致,也与之前的研究一致,即棉属进化过程中发生了全基因组重复事件,我们观察到每个 GrLPAAT 基因或 GalLPAAT 基因对应二倍体物种中的一个基因属于同源 LPAAT 组的四倍体棉花中的两个 GhLPAAT 基因。

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棉花中的 11 种假定质体 LPAAT 与之前鉴定的椰子磷脂/甘油酰基转移酶家族蛋白高度相似。 A类LPAAT组、B类LPAAT组和质体LPAAT组中的蛋白质显示出具有LPAAT活性。 然而,在拟南芥中,LPAAT4/5 亚家族的成员在体外不表现出 LPAAT 活性。

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综上所述

总共鉴定了 40 个 LPAAT 基因,并将其分为四个不同的亚科,即四个棉属物种。 、四倍体 G.hirsutum -AD 1 和 G.barbadense -AD 2 及其祖先、二倍体 G.raimondii -D 5 和 G.arboreum -A 2。

对转基因酵母中序列变异、QTL共定位和TAG含量的详细分析表明,LPAAT中的自然序列变异基因非常有限,不太可能与棉籽油和蛋白质含量以及纤维品质性状的自然变异相关。

然而,正如转基因酵母实验所证明的那样,棉花LPAAT可以增加油的成分和含量。 该结果为进一步研究阐明LPAAT基因在棉籽含油量自然变异中的作用以及提高棉籽含油量提供了重要指导。 基因工程和成分的可能策略提供了重要线索。

参考

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【3】山下A、林Y、松本N、根本佐佐木Y、冈S、谷川T、杉浦T。 甘油磷酸/酰基甘油磷酸酰基转移酶。 生物学。 2014;3(4):801–30。

【4】KorbesAP、KulcheskiFR、MargisR、Margis-PinheiroM、Turchetto-ZoletAC。 溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)基因家族的分子进化。 分子系统发育进化。 2016;96:55–69。

【5】Arroyo-CaroJM、ChilehT、AlonsoDL、Garcia-MarotoF。 蓖麻脂质中属于 MBOAT 家族的溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶基因的分子特征。 2013;48(7):663–74。